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常見問題
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【知識(shí)科普】核酸提取的常用方法及原理
目前常用的核酸提取方法有兩種：一種是柱式提取，另一種是磁珠法提取。其中自動(dòng)化提取的實(shí)現(xiàn)主要依賴于磁珠法。
柱式提取是用于微量核酸提取的較為簡(jiǎn)單的方法，屬于硅吸附方法的一種，市場(chǎng)上的離心柱雖各有特色，但在原理上通常可分為三個(gè)部分：
(1)利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來。
(2)把釋放出的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，這種載體只對(duì)核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力，對(duì)其他生化成分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則基本不吸附，因而在離心時(shí)被甩出柱子。
(3)把吸附在特異載體上的核酸用洗脫液洗脫下來，分離得到純化的核酸。
（柱式法圖解）
磁珠法提取運(yùn)用納米技術(shù)對(duì)超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識(shí)別和高效結(jié)合。利用氧化硅納米微球的超順磁性，在Chaotropic鹽（鹽酸胍、異硫氰酸胍等）和外加磁場(chǎng)的作用下，能從血液、動(dòng)物組織、食品、病原微生物等樣本中的DNA和RNA分離出來，可應(yīng)用在臨床疾病診斷、輸血安全、法醫(yī)學(xué)鑒定、環(huán)境微生物檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、分子生物學(xué)研究等多種領(lǐng)域。
（機(jī)器自動(dòng)化磁珠法圖解）
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【核酸提取常見問題】核酸提取量過少是什么原因?qū)е碌?？如何解決?
核酸提取量過少，主要原因及解決措施如下：
原因一：實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少。
解決方法：盡量選用新鮮（幼嫩）的材料。
原因二：材料破壁或裂解不充分。
解決方法：動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G+菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁；高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）。
原因三：沉淀不完全。
解決方法：(1)低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間。(2)加輔助物，促進(jìn)沉淀。
原因四：洗滌時(shí)DNA丟失。
解決方法：洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒。
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【核酸提取常見問題】DNA降解是什么原因?qū)е碌?？如何避免?/span>
DNA降解，主要原因及解決方法如下：
原因一：材料不新鮮或反復(fù)凍融。
解決方法：盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融。
原因二：未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性。
解決方法：(1)液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)站在解凍前加入裂解緩沖液。
(2)在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量。
原因三：提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷。
解決方法：細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔。
原因四：被外源核酸酶污染。
解決方法：所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌。
原因五：反復(fù)凍融。
解決方法：將DNA分裝保存在緩沖液中，避免反復(fù)凍融。
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【PCR實(shí)驗(yàn)常見問題】無擴(kuò)增產(chǎn)物（假陰性）的可能原因及解決方法有哪些？
無擴(kuò)增產(chǎn)物（假陰性）的可能原因及解決方法一覽表
序號(hào)
可能原因
解決方法
1
模板含有抑制物或模板含量低
純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量
2
Buffer對(duì)樣品不合適
更換Buffer或調(diào)整濃度
3
引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解
重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物
4
反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短
降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間
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【PCR實(shí)驗(yàn)常見問題】為何空白對(duì)照會(huì)出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物（假陽性）？如何避免？
空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物，屬于出現(xiàn)了靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染，為避免這種情況發(fā)生，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
(1)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。
(2)除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。
(3)各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。
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【ELISA實(shí)驗(yàn)常見問題】試驗(yàn)結(jié)果白板，而且陽性對(duì)照不顯色，可能原因及解決方法有哪些？
試驗(yàn)結(jié)果白板，而且陽性對(duì)照不顯色，常見原因以及解決方法如下：
(1)可能原因：漏加或者誤加試劑；
解決方法：檢查試驗(yàn)記錄和剩余試劑。每次加液前均應(yīng)核對(duì)標(biāo)簽。
(2)可能原因：試劑過期；
解決方法：使用有效期內(nèi)的產(chǎn)品。
(3)可能原因：洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈含HRP酶抑制物（疊氮鈉等）；
解決方法：使用干凈的器皿，正確配制試劑。
(4)可能原因：溫育的時(shí)間或溫度不夠；
解決方法：校正溫育箱溫度。
(5)可能原因：標(biāo)準(zhǔn)品失活或者丟失；
解決方法：標(biāo)準(zhǔn)品正確保存、溶解和混勻。
(6)可能原因：抗體失活或者丟失；
解決方法：更換抗體或者提高抗體濃度。
(7)可能原因：酶失活或者丟失；
檢查方法：把工作濃度的酶再稀釋20－100倍，取5uL加入50ul的顯色底物，終止后顯色是否能達(dá)到1.0左右，此為酶的粗略估計(jì)。
解決方法：更換酶或者提高酶的濃度。
(8)可能原因：顯色底物失活；
檢查方法：加少量的工作濃度的酶，TMB是否很快顯色。
解決辦法：更換顯色底物。
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【ELISA實(shí)驗(yàn)常見問題】實(shí)驗(yàn)結(jié)果空白背景高，是什么原因造成的？如何解決？
ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果空白背景高，常見原因如下：
(a)可能原因：洗板不干凈；
解決方法：充分洗滌，徹底拍干；洗板要防止交叉污染；濃縮洗液準(zhǔn)確配制；吸嘴盡可能一次性使用；加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染。
(b)可能原因：顯色液變質(zhì)或者試劑過期；
解決方法：檢查試劑盒有效期。
(c)可能原因：試劑稀釋有誤，如加酶的濃度過高；
解決方法：請(qǐng)按說明書所示稀釋倍數(shù)配制；
(d)可能原因：蒸餾水受酶等污染；
解決方法：使用新鮮蒸餾水。
(e)可能原因：試劑混用；
解決方法：不同批號(hào)試劑勿混用。
(f)可能原因：培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)；
解決方法：顯色反應(yīng)時(shí)間適當(dāng)縮短。
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